用于新型心脏瓣膜的热塑性硅基聚氨酯TSP

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心脏瓣膜组织工程旨在通过患者自身细胞在支架上的定植来制造活体瓣膜。目前已探索出多种细胞来源，主要侧重于支架表面的内皮化。从外周血或骨髓中分离出的内皮样细胞，如内皮祖细胞（EPCs），可能是一种合适的选择。在这项研究中，我们研究了绵羊EPCs（OEPCs）在热塑性硅基聚氨酯（TSPU）聚合物支架上的细胞定植潜力。我们使用了含或不含血管内皮生长因子（VEGF）功能化的TSPU无纺布。扫描电子显微镜图像显示，到第天，细胞在两组聚合物的表面上以斑块的形式生长。细胞斑块继续生长，并开始覆盖更多的无纺布表面。第7天，细胞几乎覆盖了支架表面。与非功能化无纺布相比，细胞在功能化TSPU上的单层分布更加均匀。活/死染色在样品上显示出明亮的绿色荧光，表明有新陈代谢活性的活细胞。这些静态细胞播种实验证明，功能化TPSU无纺布支持内皮化。TPSU无纺布作为心脏瓣膜假体支架的可行性可通过在绵羊模型中进行动物实验来进一步探索。一、简介心脏瓣膜假体工程旨在通过在合适的支架上定植患者自身的细胞来制造活体瓣膜。细胞植入支架的过程可以在植入前在体外进行，也可以在植入后在患者体内进行。在体外方法中，人们探索了各种细胞来源，主要侧重于支架表面的内皮化。有几项研究调查了通过酶解血管分离内皮细胞的方法，但这需要牺牲健康的血管。作为一种替代方法，研究人员还在研究利用内皮样细胞，如内皮祖细胞（EPCs），这种细胞可以从外周血或骨髓中分离出来。在本研究中，我们使用了绵羊内皮祖细胞（OEPCs），未来有望将聚合物心脏瓣膜植入绵羊体内进行动物实验。这些OEPCs是从绵羊血液中分离出来的，我们的研究小组已经对它们在脱细胞支架上的定植潜力进行了研究。热塑性硅基聚氨酯（TSPU）聚合物支架被用作支架材料。硅基聚氨酯已作为心脏瓣膜瓣叶材料进行过测试，在内皮化后可以更好地发挥其作用。因此，本阶段研究的目的是探讨在静态播种条件下，OEPCs在热塑性硅基聚氨酯聚合物上的定植潜力。二、材料与方法01.绵羊内皮祖细胞的培养和扩增绵羊内皮祖细胞在Nunc细胞培养瓶中培养，培养基为内皮生长培养基，添加1%（v/v）青霉素链霉素。生长培养基是将EGM-2SingleQuots?（Lonza）试剂盒中的成分混合到内皮细胞基础培养基-2（EBM-2，Lonza）中制备的。细胞在7°C、5%CO2atmosphere和85%湿度条件下培养（见图1）。细胞汇合后进行传代，然后在第三代时接种到聚合物上。图1：在培养瓶中培养和扩增的第三代OEPCs。02.聚合物样品功能化电纺聚合物样品（功能化TSPU）用于静态细胞播种实验。在功能化过程中，首先对聚合物进行血浆处理，然后用70%的乙醇灭菌七分钟，之后在无菌条件下用血管内皮生长因子（VEGF）进行功能化。为了进行比较，使用了非功能化聚合物（未经过等离子处理，也未与血管内皮生长因子偶联），即非功能化TSPU。非官能化聚合物是在无菌条件下制备的。每个聚合物样品的大小为2x2平方厘米。0.灭菌在细胞播种实验之前，用0.1%过氧乙酸（pH值为7.）对非官能化TSPU进行灭菌处理。将样品浸入过乙酸中，在轨道摇床上培养三小时。然后用无菌PBS冲洗样品六次，每次0分钟。04.细胞播种实验静态细胞播种实验在6孔板中进行。将2x2平方厘米的聚合物样品放入孔中。在每个聚合物样品上方放置半径为0.6厘米的金属环。将OEPCs悬浮在20μl培养基中，并添加到金属环内的聚合物上（见图2）。OEPC的播种密度为5x10^4个细胞/平方厘米。播种后的支架在7°C、5%CO2和85%湿度条件下培养了两个时间点：天和7天。每个时间点有三个样本。作为阳性对照，在不含聚合物的孔上培养细胞。作为阴性对照，聚合物样品与不含细胞的细胞培养基一起在孔上培养。每天更换细胞培养基，直至最后一个时间点。图2：静态细胞播种聚合物的实验装置。通过活/死染色法（ThermoFisherScientific，订货号L）检测样品中细胞的存活率。通过扫描电子显微镜（SEM）观察细胞在聚合物表面定殖的进展情况。三、结果扫描电子显微镜图像上可以清楚地看到聚合物表面的细胞。第天，可以观察到细胞在表面形成斑块，但没有覆盖整个表面（见图）。随着时间的推移，细胞斑块的面积逐渐增大，开始占据更多的聚合物表面。到第7天，细胞几乎填满了聚合物表面。有趣的是，在第7天，可以观察到两组聚合物的细胞定殖模式有所不同。在功能化TSPU的情况下，可以在覆盖聚合物的细胞片上观察到聚合物的底层纤维模式，这表明细胞牢牢地附着在功能化聚合物上。而非功能化组则没有这一特征。图：播种细胞的聚合物表面和未播种细胞的对照聚合物表面的扫描电镜图像。在进行活/死染色的样品上观察到明亮的绿色荧光，表明存在活细胞。只有少数代表死细胞的红色斑点。阳性对照也是如此（见图4）。阴性对照组只含有聚合物，没有细胞播种，既没有绿色信号，也没有红色信号。图4：图：活/死染色显示细胞在聚合物和孔板表面生长（阳性对照）。四、结论本阶段进行的静态细胞播种实验表明，OEPCs能够附着在TSPU聚合物表面并生长。研究表明，在聚合物表面培养7天后，细胞仍然存活并增殖。这些静态细胞播种实验表明，功能化TPSU无纺布支持内皮化。因此，TPSU无纺布作为心脏瓣膜假体支架的可行性可通过在绵羊模型中进行动物实验来进一步探索。富临塑胶供应有机硅聚氨酯共聚物（TSPU）

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